細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。

一、材料準(zhǔn)備

1. 儀器：凈化工作臺(tái)、 離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱。

2. 玻璃器皿：吸管（彎頭、直頭）、 培養(yǎng)瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、廢液缸。

3. 塑料器皿： 吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10ml）、15ml離心管、凍存管（1～2ml）。

4. 其他物品：微量加樣槍、紅血球計(jì)數(shù)板、記號(hào)筆、醫(yī)用橡皮膏、移液槍。

5. 試劑：D-Hanks液、小牛血清、培養(yǎng)液、雙抗（青霉素、鏈霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析純）或無色新鮮甘油。
二、細(xì)胞凍存

1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液。

2. 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰蛋白酶把單層生長的細(xì)胞消化下來，懸浮生長的細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至15ml離心管中。

3. 離心1 000 rpm，5 min。

4. 去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml。

5. 將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml。

6. 在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間及操作者。

7. 凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2℃/ min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

三、 細(xì)胞復(fù)蘇

1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。

2. 從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻。

3. 離心， 1 000 rpm，5 min。

4. 棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

5. 次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)

1. 從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但最好為對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液。

2. 將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí)，要做好防護(hù)工作，以免凍傷。

3. 凍存和復(fù)蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。

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