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DNA污染監(jiān)測的一種方法

更新時(shí)間:2020-11-13  |  點(diǎn)擊率:809

對于高靈敏的PCR技術(shù)來說,少量的DNA污染就可導(dǎo)致PCR假像或假陽性。污染的DNA來自于氣溶膠中DNA 片段。這些氣溶膠中的DNA可源自離心機(jī)、移液器和其它實(shí)驗(yàn)室設(shè)備,或從PCR反應(yīng)管中飛濺出來。它們很難去除,并可能導(dǎo)致樣品之間的交叉污染。在擴(kuò)增過程中檢測到的單個(gè)外源DNA分子,就可給整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果詮釋帶來很多問題。不幸的是,即使是經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)室,DNA污染也會偶爾發(fā)生,并且只有當(dāng)PCR檢測到時(shí),才會引起注意。

 

值得指出的是,桌面和實(shí)驗(yàn)室工作區(qū),以及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中的設(shè)備(例如離心機(jī),移液器,反應(yīng)管架等)等不同表面容易暴露于目的DNA和擴(kuò)增DNA的污染中。在實(shí)驗(yàn)前后,通過觸摸門把手,紙張,計(jì)算機(jī)鍵盤和鼠標(biāo),實(shí)驗(yàn)室操作員也會無意間攜帶和擴(kuò)散DNA污染,而不論他們是如何富有經(jīng)驗(yàn)或怎樣謹(jǐn)慎。此外,某些PCR技術(shù)如qPCR兩步法或巢式PCR,在將DNA從一個(gè)PCR轉(zhuǎn)移到下一個(gè)PCR時(shí),也增加了擴(kuò)增產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)。

 

下面筆者提供一種DNA污染監(jiān)測的一種方法,即采用SwabUp™Lab Monitoring試劑盒,可追蹤分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)DNA污染的熱點(diǎn)區(qū)域,以便有效地消除它們并防止未來再發(fā)生。 實(shí)驗(yàn)室和工作區(qū)域的定期清潔和監(jiān)控可以幫助及早發(fā)現(xiàn)和避免DNA污染。 SwabUp™Lab Monitoring試劑盒包含了用于樣品收集、DNA提取和PCR擴(kuò)增的組件,是一套能勝任環(huán)境監(jiān)測的系統(tǒng)。

SwabUp™Lab Monitoring試劑盒非常容易使用。涂抹拭子裝在密封的塑料袋中。涂抹拭子的桿由塑料制成,頂端由植絨尼龍纖維制成,具有出色的吸附性能。拭子桿上有一個(gè)模制的斷點(diǎn),方便收集樣品后拭子折斷并將其插入到含有【收集緩沖液】的Collection Buffer tube中。廣泛測試證實(shí)這種拭子非常有效。DNA提取系統(tǒng)經(jīng)過優(yōu)化,可有效檢測極小量的污染DNA。此外,在SwabUp™ Lab Monitoring Plus試劑盒中還包含無污染的即用型PCR系統(tǒng),以排除交叉污染(因用戶自己的PCR試劑和緩沖液污染而導(dǎo)致)。

該方法簡單,包括以下一般步驟:(1)使用提供的拭子收集樣本,(2DNA與純化柱的選擇性結(jié)合,(3)去除殘留的其他污染物和抑制劑,(4)純化DNA的洗脫,(5)使用凍干的SwabUp™DNAmp Mix進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

應(yīng)從容易遭受DNA污染的暴露的表面和/或設(shè)備采集樣品,如離心機(jī)、移液管、反應(yīng)管架、門把手、實(shí)驗(yàn)室書籍、計(jì)算機(jī)鍵盤、計(jì)算機(jī)鼠標(biāo)、觸摸板,臺式機(jī)以及任何分子實(shí)驗(yàn)室的工作區(qū)域。

 

應(yīng)使用拭子頭收集每個(gè)樣品,并充分擦拭每個(gè)不同的10×10厘米的表面。

 

DNA提取是必要的,可避開抑制PCR的物質(zhì),如纖維、組織、灰塵或樣本中的高豐度蛋白。因此,在PCR進(jìn)行前,應(yīng)先作DNA提取。該流程不需要酚/氯fang試劑,并且DNA提取和PCR體系制備需要的手動操作很少。DNA提取約30分鐘內(nèi)完成,并且建立PCR反應(yīng)體系只需幾分鐘,因?yàn)?/span>PCR預(yù)混液是即用型的。

 

 

操作流程一覽

 

  1. 樣本收集

 

  1. DNA 抽提
  2. 附錄I
  3. 1. 實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測和追蹤污染熱點(diǎn)區(qū)域。 
  4. 為了監(jiān)督分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室清潔程序的效率,實(shí)驗(yàn)室和環(huán)境監(jiān)測應(yīng)每三個(gè)月進(jìn)行一次。

     

    * DNA提取對照非必選,但我們建議設(shè)立該對照以驗(yàn)證DNA提取流程。

    **內(nèi)部對照非必選,它能用于驗(yàn)證PCR的擴(kuò)增。

    2. 清除和防止DNA污染的措施

    如果在實(shí)驗(yàn)室中檢測到DNA污染,則應(yīng)按以下步驟進(jìn)行:

     

    1)如果在某個(gè)區(qū)域內(nèi)檢測到DNA污染,而該區(qū)域是常規(guī)清潔程序的一部分,那么應(yīng)立即使用含次氯酸鈉的表面清潔劑再次進(jìn)行清潔(對于敏感的表面,應(yīng)尋求適當(dāng)?shù)奶娲罚?/span>

    2)對于常規(guī)清潔程序,您應(yīng)進(jìn)行修改并采取措施以改進(jìn)。

    3)如果在某個(gè)區(qū)域內(nèi)檢測到DNA污染,而該區(qū)域不是常規(guī)清潔程序的一部分,那么您應(yīng)立即將此區(qū)域納入到實(shí)驗(yàn)室常規(guī)清潔程序中,并通知所有的實(shí)驗(yàn)室操作員并進(jìn)行適當(dāng)?shù)呐嘤?xùn)。

    4)清潔后重復(fù)PCR擴(kuò)增,直到不再檢測到污染為止。

     5)確保您實(shí)驗(yàn)室中的所有操作員都充分了解這些措施,并進(jìn)行了相應(yīng)的培訓(xùn)。

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